A Cromatografia Líquida por Interação Hidrofílica (HILIC – Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) é uma técnica cada vez mais utilizada na separação de compostos polares e altamente hidrofílicos, que apresentam baixa retenção ou são mal resolvidos por HPLC de fase reversa. Baseada em mecanismos similares à cromatografia de fase normal, mas utilizando fases móveis majoritariamente aquosas e compatíveis com HPLC convencional e espectrometria de massas (MS), a HILIC oferece uma alternativa poderosa para análises de metabólitos, açúcares, aminoácidos, nucleotídeos e outros analitos polares.

Este artigo apresenta os fundamentos da HILIC, seus componentes principais, mecanismos de retenção, vantagens, limitações e principais aplicações.

1. Fundamentos da Cromatografia HILIC

A HILIC é uma técnica que combina elementos da cromatografia de fase normal com a compatibilidade operacional da fase reversa.

• A fase estacionária: É polar, como sílica desnuda, diol, amino, ciano ou zwitteriônica.

• A fase móvel: É predominantemente orgânica (geralmente acetonitrila) com uma porção aquosa (10–40%) contendo tampão ou aditivos iônicos.

A separação ocorre por interação entre os analitos polares e uma camada aquosa imobilizada na superfície da fase estacionária polar, criando um sistema de partição entre a fase móvel rica em acetonitrila e essa pseudo-fase estacionária aquosa.

2. Mecanismo de Retenção

A retenção em HILIC se dá por uma combinação de mecanismos, com predominância da partição hidrofílica:

• Partição polar dos compostos mais polares interagem com a camada aquosa da fase estacionária e são mais retidos.

• Interações eletrostáticas entre analitos ionizados e grupos funcionais da fase estacionária.

• Ligações de hidrogênio e interações dipolo-dipolo complementam a seletividade.

A retenção aumenta com o aumento da concentração de acetonitrila na fase móvel, ao contrário do que ocorre na RP-HPLC.

3. Componentes e Condições Cromatográficas

3.1. Fase Estacionária

• Sílica desnuda (SiOH)

• Diol

• Amino ou ciano (NH₂, CN)

• Zwitteriônicas (PC, sulfobetainas)

  
  

3.2. Fase Móvel

• Alta porcentagem de acetonitrila (60–90%)

• Adição de água ou tampão aquoso (10–40%), geralmente contendo NH₄OAc ou NH₄FA

• pH ajustado de acordo com a ionização dos analitos (geralmente entre 3 e 7)

4. Aplicações da HILIC

4.1. Bioanálises e Metabolômica

• Análise de aminoácidos, nucleotídeos, açúcares, fosfatos e metabólitos polares

• Compatível com MS (alta eficiência e baixa supressão iônica)

  
  

4.2. Indústria Farmacêutica

• Impurezas polares de fármacos

• Substâncias altamente hidrofílicas não retidas por RP-HPLC

• Determinação de compostos de degradação hidrossolúveis

  
  

4.3. Alimentos e Bebidas

• Açúcares, álcoois polares, vitaminas solúveis em água

• Compostos com grupos polares como polifenois e alcaloides

  
  

4.4. Análises Ambientais

• Resíduos de herbicidas e pesticidas polares

• Contaminantes emergentes e solúveis em água

5. Vantagens da HILIC

• Excelente retenção e separação de compostos altamente polares

• Alta compatibilidade com detectores por espectrometria de massas (MS)

• Uso eficiente de acetonitrila (alta transparência UV e baixa viscosidade)

• Boa seletividade complementar à fase reversa

• Pode ser usada como abordagem ortogonal em validações analíticas

6. Limitações e Cuidados Específicos

• Requer tempo de equilíbrio maior que RP-HPLC

• Sensível à composição exata da fase móvel (influência forte de % de água e tampão)

• Alguns analitos muito polares ainda apresentam baixa retenção

• Interações múltiplas podem dificultar a reprodutibilidade e robustez do método

• As colunas HILIC não são todas equivalentes – fase estacionária deve ser selecionada com base na natureza do analito

  
  

Conclusão

A HILIC preenche uma lacuna crítica deixada pela cromatografia de fase reversa, oferecendo retenção e resolução superiores para compostos altamente polares. Sua capacidade de operar com altos teores de acetonitrila e sua compatibilidade com MS fazem dela uma ferramenta poderosa em bioanálises, farmacêutica e controle de qualidade de substâncias hidrossolúveis.

Compreender os mecanismos de retenção e os parâmetros críticos da HILIC é essencial para o desenvolvimento de métodos robustos e eficientes. Quando aplicada corretamente, a HILIC amplia significativamente a capacidade de separação e análise de compostos em matrizes complexas.

Referências Bibliográficas

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• United States Pharmacopeia (USP). Chapter <621> Chromatography.

• ICH Q2(R1). Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology.