A cromatografia líquida de fase normal (NP-HPLC) foi uma das primeiras formas desenvolvidas de HPLC e, embora tenha sido em parte substituída pela fase reversa, ainda desempenha um papel estratégico em aplicações específicas, especialmente na separação de compostos apolares e isômeros estruturais.

Com uma abordagem baseada em interações polares, a NP-HPLC oferece seletividade distinta e é particularmente útil para compostos que não são bem resolvidos em sistemas de fase reversa. Este artigo apresenta os fundamentos da cromatografia de fase normal, discutindo seu princípio de funcionamento, os componentes do sistema cromatográfico, e suas principais aplicações em análises químicas e bioanalíticas.

Fundamentos da HPLC de Fase Normal

Na HPLC de fase normal, a separação ocorre por meio da interação entre compostos polares e uma fase estacionária também polar, com uma fase móvel apolar.

Fase Estacionária

A fase estacionária é normalmente composta por sílica não modificada ou funcionalizada com grupos polares. Os principais tipos incluem:

• Sílica desnuda (SiOH)

• Amino (NH₂)

• Ciano (CN)

• Diol

  
  

Essas fases apresentam forte capacidade de interação com compostos polares por meio de ligações de hidrogênio e interações dipolares.

Fase Móvel

Na NP-HPLC, utiliza-se uma fase móvel com baixa polaridade. Os solventes mais comuns são:

• Hexano

• Heptano

• Éter etílico

• Clorofórmio

• Diclorometano

Em muitos casos, adiciona-se um modificador polar, como etanol, acetona ou isopropanol, para ajustar a polaridade e controlar a eluição dos analitos.

Mecanismo de Separação

A separação em fase normal é baseada na afinidade relativa dos analitos pela fase estacionária polar. Compostos mais polares interagem fortemente com a fase estacionária e, portanto, apresentam maior tempo de retenção. Compostos menos polares têm menor afinidade e eluem mais rapidamente.

As principais interações envolvidas são:

• Ligações de hidrogênio

• Interações dipolo-dipolo

• Interações de adsorção em superfície de sílica

• 
  

O controle da separação é feito ajustando a polaridade da fase móvel e, em alguns casos, utilizando fases estacionárias modificadas para alterar a seletividade.

Vantagens da Fase Normal

• Alta seletividade para compostos polares ou com grupos funcionais semelhantes.

• Capacidade de separar isômeros estruturais e estereoisômeros, o que pode ser desafiador na fase reversa.

• Aplicável a compostos lipofílicos que são eluídos de forma inadequada ou com baixa resolução em RP-HPLC.

• Uso frequente em cromatografia preparativa e purificação de compostos sintéticos ou naturais.

Aplicações da HPLC de Fase Normal

Indústria Farmacêutica

• Separação de intermediários sintéticos e impurezas apolares.

• Resolução de enantiômeros e isômeros geométricos com colunas quirais baseadas em fase normal.

• Purificação de princípios ativos e avaliação de pureza de matérias-primas.

Química Orgânica e Síntese

• Purificação preparativa de compostos orgânicos apolares ou funcionalizados.

• Separação de frações em síntese multicomponente e extrações naturais.

Indústria de Alimentos e Óleos

• Análise de ácidos graxos, óleos, lipídeos e ceras.

• Avaliação de contaminantes apolares em produtos alimentícios.

Produtos Naturais e Fitoterápicos

• Separação de alcaloides, terpenos, flavonoides e outros compostos bioativos com perfil polar intermediário.

Nutrição Animal

• Determinação de vitaminas lipossolúveis.

Considerações para Desenvolvimento e Otimização de Métodos em NP-HPLC

Escolha da Fase Estacionária

A seleção da coluna deve ser feita com base na polaridade dos analitos e no tipo de interação desejada. A sílica desnuda oferece forte retenção de compostos polares, enquanto fases como ciano ou amino modulam a seletividade e reduzem caudas de picos.

Composição da Fase Móvel

A fase móvel deve ser rigorosamente controlada quanto à polaridade e ao teor de água. A umidade interfere fortemente na interação dos analitos com a fase estacionária, comprometendo a reprodutibilidade.

Equilíbrio e Condicionamento da Coluna

O tempo de equilíbrio da coluna com a fase móvel deve ser suficiente para garantir estabilidade da linha de base e da retenção. Recomenda-se equilibrar a coluna por pelo menos 10 volumes antes da análise.

Compatibilidade com Detecção

A escolha da fase móvel deve considerar a compatibilidade com o detector. Alguns solventes comuns na NP-HPLC, como hexano e éter etílico, possuem elevada absorvância no UV e podem interferir na detecção.

Limitações e Cuidados na HPLC de Fase Normal

• Alta sensibilidade à umidade: A presença de traços de água pode desestabilizar a retenção e reduzir a seletividade.

• Menor reprodutibilidade entre lotes de colunas: As superfícies de sílica podem apresentar diferenças significativas entre fabricantes ou lotes.

• Maior risco operacional com solventes inflamáveis: Os solventes apolares utilizados são voláteis e exigem medidas rigorosas de segurança.

• Menor compatibilidade com espectrometria de massas: Devido à baixa volatilidade e à composição orgânica da fase móvel, o uso com MS é mais restrito.

• Necessidade de preparo do equipamento: Devido a aplicação ser de menor utilização, os HPLC's não vem preparado para rodar diretamente NP-HPLC, é necessário para evitar surpresas, que itens sensíveis sejam trocados no RP-HPLC.

Conclusão

A HPLC de fase normal continua sendo uma técnica valiosa para separações que exigem seletividade baseada em interações polares. Apesar de menos comum na rotina moderna, sua aplicação é insubstituível em casos como separação de isômeros, purificação de compostos lipofílicos e análises de produtos naturais.

O conhecimento aprofundado dos fundamentos da NP-HPLC e o controle rigoroso das variáveis envolvidas são essenciais para o sucesso em aplicações analíticas e preparativas que demandam esse tipo de separação. A escolha entre fase normal e fase reversa deve ser estratégica, orientada pela natureza dos analitos e pelos objetivos da análise.

Referências Bibliográficas

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• European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) (2021). Chapter 2.2.46 - Chromatographic Separation Techniques.

• United States Pharmacopeia (USP) (2021). USP General Chapter <621> Chromatography.