A cromatografia por exclusão de tamanho, também conhecida como SEC (Size-Exclusion Chromatography) ou GPC (Gel Permeation Chromatography), é uma técnica poderosa utilizada para a separação de moléculas com base em seu tamanho hidrodinâmico ou peso molecular. Diferente das formas mais comuns de HPLC que dependem de interações químicas (como polaridade ou hidrofobicidade), a SEC se baseia exclusivamente em exclusão física, sendo amplamente utilizada na análise de proteínas, polímeros, peptídeos, polissacarídeos e agregados.

Este artigo explora os fundamentos da SEC/GPC, seus mecanismos de separação, componentes do sistema, vantagens e limitações, além das aplicações mais relevantes em bioanálises, indústria farmacêutica e materiais poliméricos.

1. Fundamentos da SEC/GPC

Na SEC, os analitos são separados de acordo com seu volume de exclusão, ou seja, sua capacidade de penetrar nos poros da fase estacionária.

• Moléculas maiores não entram nos poros e eluem mais rapidamente.

• Moléculas menores penetram nos poros e, portanto, têm tempo de retenção maior.

  
  

Não há interação química significativa com a fase estacionária – a separação ocorre exclusivamente por tamanho efetivo em solução (volume hidrodinâmico).

O termo GPC é mais comum em aplicações com solventes orgânicos e polímeros sintéticos, enquanto SEC é usado para biomoléculas e sistemas aquosos.

2. Mecanismo de Separação por Exclusão

A coluna cromatográfica é preenchida com partículas porosas de gel (sílica ou polímero reticulado). A separação segue este princípio:

• A fase móvel carrega a amostra através da coluna.

• Analitos grandes passam entre os poros e saem primeiro.

• Analitos pequenos penetram mais profundamente nos poros e demoram mais para eluir.
  
  

A separação depende de:

• Diâmetro efetivo dos poros do gel

• Forma da molécula (não apenas peso molecular)

• Condições do solvente (pH, força iônica, viscosidade)

3. Componentes do Sistema Cromatográfico

3.1. Colunas

• Colunas de SEC aquosa: para proteínas, peptídeos, polissacarídeos

• Colunas de GPC orgânica: para polímeros sintéticos, materiais plásticos

• Poros calibrados para diferentes faixas de peso molecular (ex: 100–10⁶ Da)

3.2. Fase Móvel

• SEC: tampões neutros ou fisiológicos (PBS, Tris-HCl)

• GPC: solventes orgânicos como THF, tolueno, clorofórmio, DMF

• A fase móvel deve manter a molécula solubilizada e em conformação nativa

3.3. Detectores

• RI (Índice de refração): comum em GPC de polímeros

• UV/Vis: para biomoléculas com cromóforos (proteínas, ácidos nucleicos)

• LS (Light Scattering): para determinação absoluta de massa molar

• MS: menos comum, mas possível com SEC acoplada a ESI-MS

4. Aplicações da SEC/GPC

4.1. Proteínas e Biomoléculas

• Determinação de massa aparente (monômeros, dímeros, agregados)

• Análise de pureza, estabilidade e perfil de agregação

• Estudos de degradação por estresse ou armazenamento

4.2. Polímeros Sintéticos

• Determinação de distribuição de peso molecular (Mw, Mn, PDI)

• Controle de qualidade de matérias-primas

• Estudo de degradação térmica ou oxidativa

4.3. Produtos Farmacêuticos

• Análise de vacinas, anticorpos monoclonais (mAbs), conjugados

• Estudos de formulação e estabilidade de biológicos

• Comparabilidade entre lotes (biossimilares)

4.4. Polissacarídeos, Gomas e Produtos Naturais

• Determinação de tamanho e pureza de polissacarídeos e mucilagens

• Controle de qualidade em alimentos, cosméticos e farmacêuticos naturais

5. Vantagens da Cromatografia por Exclusão de Tamanho

• Técnica não destrutiva

• Separação rápida e reprodutível baseada apenas em tamanho

• Pode ser usada para estimativa de peso molecular e homogeneidade

• Compatível com biomoléculas frágeis e polímeros sintéticos complexos

• Facilmente acoplável a detectores múltiplos (UV, RI, LS, viscosidade)

6. Limitações e Cuidados

• Baixa capacidade de resolução fina, moléculas de tamanho muito próximo podem não ser separadas

• Não aplicável para moléculas interativas com a matriz (ex: adsorção indesejada)

• Interpretação depende de calibração adequada (curvas padrão ou detecção absoluta)

• Exige controle rigoroso da temperatura e viscosidade da fase móvel

• O tamanho hidrodinâmico nem sempre reflete o peso molecular exato

  
  

  
  

Conclusão

A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC/GPC) é uma ferramenta indispensável para caracterização de macromoléculas, com ampla aplicação em bioanálises, farmacêutica, polímeros e ciência dos materiais. Sua natureza suave, seletiva e robusta permite determinar com precisão o tamanho e o comportamento conformacional de moléculas grandes em solução. Quando utilizada corretamente, com colunas adequadas e calibração apropriada, a SEC/GPC proporciona dados críticos para o desenvolvimento, controle e garantia de qualidade de moléculas complexas.

Referências Bibliográficas

• Barth, H. G., & Boyes, B. E. (1990). Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography. Wiley.

• Hong, P., Koza, S., & Bouvier, E. S. (2012). Size-exclusion chromatography for the analysis of protein biotherapeutics and their aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies.

• ASTM D5296-19. Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography.

• USP General Chapter <129> SEC for Protein Analysis

• ICH Q6B. Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products.